شناسایی و تولید پروتئین متصل شونده به فریک انتروباکتین (fepa)

باکتری اشرشیاکلی o157: h7 (e.coli o157: h7)، از زیر گروه اشرشیاکلی های خونریزی دهنده داخلی انترو هموراژیک {enterohemorrhagic escherichia coli (ehec) } می باشد. این باکتری تولید کننده ی توکسینی شبیه شیگا توکسین (shiga-like toxin) می باشد که در ایجاد اسهال-های خونی، غیر خونی و سندروم یورمی همولیتیک نقش دارد. سندروم یورمی همولیتیک یک عامل مهم ناتوانی کلیوی در کودکان و بزرگ سالان است. این باکتری برای ایجاد عفونت در میزبان پرسلولی نیاز به آهن دارد که به شدت به وسیله میزبان پر سلولی محدود می شود. یکی از استراتژی های اشرشیاکلی o157:h7 برای غلبه بر استرس آهن تولید سیدروفور انتروباکتین است که به طورکلی به وسیله همه سویه های اشرشیاکلی در شرایط استرس آهن تولید می شود. ژن fepaاز باکتری اشرشیاکلی o157:h7 با 2241 جفت باز، پروتئین غشایی به نام پروتئین اتصالی فریک انتروباکتین را کد می کند که برای جذب فریک آنتروباکتین در باکتری اشرشیاکلی ضروری است. در صورتی که به توانیم مانع از جذب آهن توسط این باکتری شویم، می توان میزبان را در برابر تهاجم این باکتری ایمن نمود. در این مطالعه تاثیر ایمنی زایی پروتئین نوترکیب غشایی fepa علیه باکتری اشرشیاکلی o157:h7 مورد بررسی قرار گرفت. به منظور تهیه پروتئین نوترکیب fepa، پس از کشت باکتری اشرشیاکلی o157:h7، ژنوم آن تخلیص شد. با کمک واکنش زنجیره پلی مراز ژن fepa از اشرشیاکلی به طول 2241 جفت باز فراوان سازی و سپس روی ناقل بیانی pet28a+کلون شد. پس از انتقال سازه نوترکیب به میزبان اشرشیاکلی سویه bl21de3، بیان پروتئین مورد نظر توسط غلظت های مختلف ایزوپروپیل تیو بتا- دی گالاکتوزید (iptg) القاء و بهینه سازی آن انجام شد. نتایج بیان با sds-page بررسی و پروتئین نوترکیب از طریق کروماتوگرافی میل ترکیبی با کمک ستون ni-nta تخلیص شد. در نهایت پروتئین نوترکیب تولیدی با وزن مولکولی 85 کیلودالتون به موش های balb/c تزریق و پس از تکمیل دوره ایمن سازی، تیتر آنتی بادی با سنجش الایزا مورد ارزیابی قرار گرفت. تزریق این پروتئین نوترکیب به موش های balb/c نشان داد که این پروتئین قادر به تحریک سیستم ایمنی و تولید آنتی بادی است. تست الایزا نشان داد که آنتی بادی تولید شده در شناسایی پروتین اتصالی فریک انتروباکتین قدرت بالایی دارد و موش -های ایمن شده با این پروتئین در مواجه با باکتری زنده تا ld50 106 از خود مقاومت نشان دادند. توالی ژن fepa باکتری اشرشیاکلی o157:h7 با توالی این ژن در باکتری های شیگلا فلکسنری، کلبسیلا پنومونیه و سالمونلا تیفی همولوژی بالای 79 درصد را نشان می دهد؛ بر این اساس موش های ایمن شده با این پروتئین نوترکیب در مواجه با باکتری های زنده یاد شده به ترتیب 109ld50، 109ld50 و 106ld50 از خود مقاومت نشان دادند.